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Physiopathologie et spectre d'hôte des densovirus, perspectives en lutte biologique
(ACR)
- Mot(s) clé(s) :
Objet d'étude : barrière intestinale, densovirus
Dispositif technique et méthode d'étude : spectre d'hôte
Phénomène, processus et fonction : infection per os, spécificité moléculaire
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Objet d'étude : barrière intestinale, densovirus
Dispositif technique et méthode d'étude : spectre d'hôte
Phénomène, processus et fonction : infection per os, spécificité moléculaire
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- Description détaillée :
- Approche au niveau de l'hôte : caractérisation du transcriptome de la cellule intestinale de Afficher la suite
- Approche au niveau de l'hôte : caractérisation du transcriptome de la cellule intestinale de Spodoptera frugiperda. Détermination des transcrits spécifiques par comparaison des banques EST des différents tissus.

- Analyse du processus d'infection au niveau microscopique (microscopie confocale et électronique).

- Isolement et clonage du récepteur, par une approche protéomique. L'infection des insectes par leurs pathogènes se fait la plupart du temps per os, impliquant un processus d'adhésion aux cellules de la membrane intestinale. Si des données existent concernant ce processus dans le cas de toxines de bactéries entomopathogènes telles que Bacillus thuringiensis, il n'en est presque rien en ce qui concerne les virus.
Les baculovirus, modèles d'étude au laboratoire, produisent une forme virale spécialisée dans la transmission d'hôte à hôte, que l'on appelle corps d'inclusion et qui contient des virions infectieux.Un tiers du génome viral est consacré à la production de cette forme spécialisée et 3 gènes impliqués dans l'infectiosité ont été identifiés : pif, pif-2 et p74. La délétion de l'un d'eux entraine en effet une perte d'infection et les comparaisons de séquences suggèrent leur spécifité pour les baculovirus, ainsi qu'un espécificité du mécanisme en jeu : la fusion des membranes à pH basique.
Les autres laboratoires impliqués sur le sujet :
- Volkman (Berkeley): histologie et physiologie de l'intestin de Lépidoptères,
- Vlak (Wageningen): description de pif-2,
- Caballero (Espagne) : aspects populationnels et lutte biologique,
- Mauchamp (Lyon) : UNS (Unité natioanle Séricicole, Lyon): étude du facteur de sensibilté ou résistance au baculovirus du ver à soie.

- le densovirus JcDNV traverse le tissu intestinal sans s'y multiplier, se développe surtout dans les trachées, les tubes de Malpighi, et revient secondairement dans l'intestin où il est relargué ;
-les infections tardives n'ont pas d'effet sur le développement larvaire mais se traduisent par une nymphose anormale ;
-la pénétration du densovirus se fait par un processus d'endocytose médié par des vésicules à clathrine ;
-la transcritpion d'un faible nombre de gènes est affectée par la multiplication du densovirus.



Les étapes essentielles de la conduite du projet seront les suivantes :

a) Identification des étapes spatio-temporelles de l'infection
Dans le cas du baculovirus, le rôle des trois gènes dont la délétion conduit à une perte d'infectiosité des virions inclus (ODV) sera étudié au moyen de la construction de virus mutants pour chacun des gènes, ou en combinaison. La confirmation d'un blocage, chez les mutants, avant la transcription, s'établira au moyen d'analyse transcriptomique sur les intestins immédiatement après infection par des virus délétés de l'un ou l'autre des gènes pif (per os infectivity factor). La détermination de la phase précise sur laquelle chacun des produits des gènes agit (adhésion, fusion des membranes, internalisation ou transport) sera analysée au moyen de l'imagerie, de la microscopie confocale ou à déconvolution spectrale, ou par l'étude de l'implication des radeaux lipidiques dans le transport des nucléocapsides vers la base des micro-villosités (coll. INRA Antibes). Des résultats préliminaires concernant des mutants délétés de pif ont démontré la pertinence de cette approche.

b) Recherche des partenaires cellulaires
Il a été démontré qu'un traitement des micro-villosités par des protéases inhibe l'infection. Il est donc vraisemblable que des protéines présentes sur la membrane de ces micro-villosités jouent un rôle fondamental dans le processus d'infection. De plus, les ODV ayant une spécificité tissulaire marquée (infectiosité très réduite pour les autres types cellulaires), on peut s'attendre à une transcription différentielle de ces partenaires entre le tissu digestif et les autres tissus de l'insecte. Notre recherche dans cette direction s'appuiera sur trois types d'outils.
La recherche de candidats dont l'expression est régulée fait partie de l'approche transcriptomique (ESTs, banques différentielles) et sera développée à partir de nos acquis actuels. Nous identifierons tout d'abord les séquences EST spécifiques de l'intestin, en confortant cette approche par comparaison avec les données disponibles sur d'autres lépidoptères. Nous utiliserons ces séquences pour enrichir la puce ADN de S. frugiperda qui pourra être testée sur des intestins à différents stades et en conditions d'infection.
L'identification des protéines majeures du tube digestif et de leur variation (étude protéomique) prendra ici tout son sens. En collaboration avec l'IRD de Montpellier (C. Bregidou), nous comptons d'abord mettre au point la purification et l'analyse des protéines membranaires et des protéines solubles à partir du tissu intestinal. Ces différentes fractions seront comparées après migrations sur gels 2D. Les spots exprimés de façon différentielle feront l'objet de spectrométrie de masse et les peptides dérivés seront analysés en Maldi-Tof.
L'analyse des interactions entre protéines virales et cellulaires pourra également être testés par co-précipitation ou par la méthode du double hybride (collaboration Inst. Pasteur).

Au cours des deux ans à venir nous comptons également développer nos relations au sein d'un réseau d'acteurs concernés à divers titres par la physiologie et la biologie moléculaire du tissu intestinal, entre autres à travers l'étude (avec l'UNS de Lyon) d'une protéine spécifique permettant la résistance au baculovirus, mise en évidence chez B. mori. Selon nos expériences préliminaires, elle serait présente également chez S. frugiperda. Une autre interaction se fera avec le groupe de Sophia-Antipolis (R. Feyereisen, D. Pauron) qui a construit des banques spécifiques de cDNA d'intestin de S. frugiperda soumis à différents stress alimentaires.
Le développement de résistances par les insectes au niveau du tube digestif est l'un des grands enjeux qui se présentent au niveau international. En effet, qu'il s'agisse de contrôler l'apparition de résistances chez les ravageurs des cultures, ou de développer des résistances face aux pathogènes chez les insectes utiles ou vecteurs, seul le développement d'un corpus de connaissances sur le tube digestif et sa dynamique peut permettre des avancées significatives.

Par ailleurs l'utilisation future du densovirus comme outil de lutte biologique est plus que vraisemblable, et nécessite une étude plus précise du mode d'action du virus et de son spectre d'hôte. B. Mauchamp (UNS)

B. Giordana (Milan, Itale)

P. Tijssen (Canada)

D. Fontenille (IRD Montpellier)
La caractérisation des gènes exprimés dans les tissus intestinaux de l'hôte Spodoptera frugiperda.

Plusieurs axes seront développés, qui visent : (i) à comprendre le mécanisme d'action de ces gènes dans l'infection intestinale, en déterminant le site et le moment où ils interviennent ; pour cela, des analyses seront faites en condition d'infection hétérologues ; (ii) à identifier les raisons de la spécificité des densovirus pour différents insectes, et cela en commençant par la recherche des partenaires cellulaires de ces protéines virales chez S. frugiperda mais aussi en réalisant des construcitons hybrides ; (iii) à partir de ces observations, élargir la définition de la spécificité moléculaire du tissu intestinal de l'insecte. L'étude des densovirus de lépidoptères bénéficie des acquis sur les parvovirus de vertébrés. Nous avons identifié les transcrits du JcDNV, le rôle de plusieurs des protéines majeures dans la formation de la particule virale, et l'implication de 2 des protéines non structurales dans la réplication et probablement l'intégration dans le génome cellulaire. Chez les insectes, le système digestif est l'organe qui présente le plus d'échanges avec le milieu extérieur. L'exosquelette constituant une barrière presque absolue, le tube digestif constitue le seul point franchissable pour la plupart des pathogènes (virus, bactéries, parasites). L'infection se fait donc per os et le passage des virus (entomopathogènes , ou simplement vectés par l'insecte) dépend de leur adhésion aux cellules intestinales et de leur internalisation. Or ce processus est très peu connu alors qu'il est à la base des résistances que les insectes sont capables de développer et par ce fait un enjeu majeur au niveau international.

Le présent projet s'appuie sur le modèle densovirus et s'intéresse à décrire et analyser l'infection virale : étapes de la pénétration par le tissu intestinal, analyse à différents stades larvaires, conséquences sur le développement et la physiologie de l'hôte, envahissement ultérieur des autres tissus.

Les approches utilisées sont variées :
- physiopathologie de l'infection,
- influence du densovirus sur le transcriptome de l'hôte (soit sur cultures cellualires, soit dans les tissus),
- isolement du récepteur et de partenaires cellulaires,
- spectre d'hôte de différents densovirus chez plusieurs insectes,
- polymorphisme du génome du virus et lien éventuel avec la virulence. Réduire

- Champs de rattachement :
 

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