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Biochimie fonctionnelle des transporteurs d'ions : relation structure-fonction
(ACR)
- Mot(s) clé(s) :
Objet d'étude : arabidopsis thaliana, membrane plasmique, protéine recombinante
Dispositif technique et méthode d'étude : chromatographie, clonage, électrophorèse, purification de protéines, sonde moléculaire, spectrofluorométrie, spectrométrie de masse
Composé chimique, Facteur du milieu : liposome, nitrate, tonoplaste
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Objet d'étude : arabidopsis thaliana, membrane plasmique, protéine recombinante
Dispositif technique et méthode d'étude : chromatographie, clonage, électrophorèse, purification de protéines, sonde moléculaire, spectrofluorométrie, spectrométrie de masse
Composé chimique, Facteur du milieu : liposome, nitrate, tonoplaste
Phénomène, processus et fonction : expression hétérologue dans la levure, solubilisation-réinsertion de protéines membranaires
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- Description détaillée :
(1) isolement in vitro de la membrane plasmique et vacuolaire (modèles : A. thaliana ; S cerevisiae Afficher la suite
(1) isolement in vitro de la membrane plasmique et vacuolaire (modèles : A. thaliana ; S cerevisiae). Outils : centrifugations différentielles, gradient de densité, détection ou activité de protéines marqueurs,
(2) Analyse de protéomes sub-cellulaires : répertoires, profilages, modifications post-traductionnelles. Outils : chromatographies 2D moyenne pression, électrophorèse, spectrométrie de masse MALDI TOF, ESI MS/MS (plate-forme protéome INRA Montpellier),
(3) Clonage de protéines de transport; expression héterologue (levures) ; purification de protéines recombinantes,
(4) Analyse électrophysiologie in vitro du transport de nitrate. Outil : spectrofluorimétrie multicanal, sondes moléculaires fluorescentes de gradients électrochimiques au travers de vésicules membranaires).
L'absorption cellulaire de nitrate découle du bilan entre son influx (actif) et son efflux (passif) opérés par des transporteurs différents. Le stockage dans la vacuole rend compte de la teneur en nitrate des tissus végétaux. Aucun transporteur d'efflux cellulaire de la membrane plasmique, de même qu'aucun transporteur vacuolaire, n'a encore été caractérisé.
Dans cette situation, une stratégie de type protéome menée au niveau subcellulaire présente plusieurs intérêts. La spectrométrie de masse permet d'identifier quels sont les membres des 2 familles de gènes de transporteurs de nitrate déjà connues (familles NRT1 comprenant plus de 50 membres et NRT2) qui sont exprimés dans un compartiment cellulaire donné et dans différentes situations physiologiques. Le profilage dans différentes situations d'alimentation en nitrate pourrait permettre aussi de découvrir dans les membranes terminales de nouveaux transporteurs (n'appartenant pas à des familles déjà connues). L'intérêt spécifique des approches protéomes reste cependant d'apporter des informations complémentaires de celles obtenues par une analyse au niveau des transcrits, sur les variations d'abondance des protéines de transport dans différentes situations ainsi que sur leurs modifications post-traductionnelles. Cependant, il faut noter que les protéines intégrales ne sont pas séparables par électrophorèse 2D, étape préalable classique des analyses protéomiques.
D'autre part, la caractérisation fonctionnelle au plan moléculaire des transporteurs de nitrate par expression héterologue dans le xénope est très délicate, souvent impossible. Une approche in vitro sur vésicules membranaires isolées est majoritairement retenue dans la littérature pour caractériser les enzymes de transport, mais il n'existait pas de méthodologie permettant de mesurer à ce niveau l'activité des transporteurs de nitrate.
L'équipe s'est donc engagée dans la mise au point de nouveaux outils permettant d'une part une analyse protéomique subcellulaire (séparation des protéines membranaires par chromatographie 2D moyenne pression, contrats Génoplante et Aventis Pharma), et d'autre part la caractérisation des systèmes de transport de nitrate sur vésicules isolées (multiple marquage par sondes fluorescentes). Elle s'est également engagée dans l'expression héterologue de protéines recombinantes de transport (fusion avec une queue histidine).
(1) isolement de la membrane plasmique de A. thaliana (réalisée) ; vacuole (en cours),
(2) nouvelle méthode d'analyse électrophysiologique in vitro du transport de nitrate (réalisée),
(3) nouvelles méthodes d'analyse de protéomes subcellulaires membranaires (programme Génoplante : juin 2000-juin 2002 ; programme Aventis-Pharma : fin 2001-fin 2003),
(4) clonage de nouveaux transporteurs putatifs de nitrate,
(5) profilage en fonction de l'alimentation nitrique (2002).
La caractérisation des bases moléculaires des systèmes membranaires impliqués dans le transport de nitrate est d'abord nécessaire à la compréhension de la physiologie de la nutrition. D'autre part, les transporteurs sont des déterminants majeurs de la teneur en nitrate des produits végétaux consommés, et de l'utilisation efficace de cet intrant majeur de l'agriculture et principal poluant des cours d'eau et des nappes phréatiques. Une bonne connaissance de ces déterminants est nécessaire pour une meilleure maîtrise de ces problèmes. (1) Plate-forme protéome INRA Montpellier.
(2) Équipe Intégration des fonctions nutritives (UMR5004).
(3) Équipe Morphogénèse racinaire (UMR5004).
(4) Équipes Aventis-Pharma et Institut Pasteur (approche protéome subcellulaire modèle sur S. cerevisiae).
- Caractérisation de protéomes subcellulaires (membrane plasmique, vacuole).
- Analyse des modifications post-traductionnelles des protéines membranaires ("phosphoprotéome" membranaire) ; réponse des systèmes de transport de nitrate à des variations d'alimentation en nitrique.
- Recherche protéomique des protéines en interaction avec les transporteurs (analyse de complexes natifs de protéines).
- Analyse protéomique différentielle (profilage de différentes situations d'alimentation en nitrate) : recherche de nouveaux transporteurs de nitrate et des protéines de régulation.
- Identification, clonage et caractérisation biochimique et fonctionnelle des composants des systèmes de transport de nitrate des membranes terminales des cellules de A. thaliana.
(1) Mise au point d'une nouvelle méthodologie pour mesurer in vitro l'activité d'efflux passif de nitrate (Biophys J 1999, 76: 360-373),
(2) Mise en évidence au plan fonctionnel in vitro d'un transport constitutif d'efflux passif dans la membrane plasmique, présentant le même pH optimum acide que la H+-ATPase (Plant Physiol 2000, 122: 265-273),
(3) Mise en évidence au plan fonctionnel in vitro d'un transport inductible d'efflux passif dans la membrane plasmique présentant un pH optimum neutre,
(4) Identification d'une centaine de protéines intégrales de la membrane plasmique de A thaliana (dont 2 nouveaux tansporteurs putatifs de nitrate),
(5) Clonage de 2 transporteurs putatifs de nitrate de la membrane plasmique ; expression dans la levure (protéines recombinantes).
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- Champs de rattachement :
 

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