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Thérapie génique des lésions musculaires congénitales
(ACR)
- Mot(s) clé(s) :
Objet d'étude : muscle
Dispositif technique et méthode d'étude : thérapie génique
Composé chimique, Facteur du milieu : aav, myopathie, utrophine
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Objet d'étude : muscle
Dispositif technique et méthode d'étude : thérapie génique
Composé chimique, Facteur du milieu : aav, myopathie, utrophine
Phénomène, processus et fonction : myopathie de duchenne
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- Description détaillée :
Les compétences réunies au laboratoire nous conduisent à développer une approche sur l'animal Afficher la suite
Les compétences réunies au laboratoire nous conduisent à développer une approche sur l'animal modèle particulièrement sur gros animal qui permet d'évaluer les difficultés pratiques des thérapies.

Modèles utilisés : souris mdx et chiens GRMD, modèles expérimentaux de nécrose toxique chez le rat.

Outils : AAV recombinants, Adénovirus, vecteurs inertes, ADN nu. Évaluation des conséquences de la transduction par histologie, immunohistochimie et histomorphométrie.
Le contexte scientifique est celui de la thérapie génique, qui n'a pour le moment montré son efficacité que dans de rares situations de maladies génétiques hématologiques. les difficultés de la thérapie de la dystrophie musculaire de Duchenne sont ceux des autres maladies génétiques auxquelles s'ajoutent des difficultés particulières : la très grande taille du gène à transduire (la dystrophine est la plus grosse proteine actuellement connue) et le volume du tissu à transduire (40% du poids du corps avec des muscles très peu accessibles).

La médiatisation des potentialités de la thérapie génique et cellulaire a généré un espoir très imortant chez les malades.
Laboratoire de Thérapie génique, CHU de nantes (Philippe Moullier).

LRMBM, CHU de Rennes (Elisabeth LeRumeur, Jacques de Certaines).

Bruno Pitard, INSERM U533, Nantes.
1- Thérapie génique de la dystrophie musculaire de Duchenne

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une myopathie congénitale provoquée par la mutation du gène de la dystrophine touchant 1 garçon sur 3500 et se traduisant par des lésions musculaires de nécrose-régénération associées à une fibrose ; ces lésions entraînent la mort avant l'âge adulte.
La dystrophine est une protéine de structure stabilisant la membrane, formant un réseau sous-membranaire qui lie le cytosquelette de la fibre musculaire à la membrane basale par l'intermédiaire de protéines membranaires qui constituent le DGC (Dystrophin glycoproteins complex).
Pour traiter cette dystrophie musculaire, il est nécessaire d'exprimer la dystrophine (ou équivalent) dans au moins 25 pour cent des fibres musculaires de chaque muscle de l'organisme. Il faut, par ailleurs, que l'expression du transgène soit pérenne et que l'organisme ne rejette pas la protéine néo-synthétisée.

A- Transfert de micro dystrophine par l'AAV

La dystrophine est la plus volumineuse protéine connue et son gène fait 13.5 Kb. Il est trop volumineux pour être porté par les vecteurs viraux candidats à la thérapie génique. Des formes tronquées de la dystrophine conservent une part de la fonctionnalité de la protéine originale ; elles sont à l'origine de maladies moins graves que la DMD. La transduction de formes tronquées du gène chez la souris a montré une capacité à restaurer un phénotype proche de la normale. Nous construisons, pour le modèle canin de la DMD, des formes tronquées (micro-dystrophine) par suppression de motifs répétés au centre de la protéine. La stratégie de construction de la mini-dystrophine canine (6.3 Kb) consiste à déleter les exons 17 à 48 (c'est-à-dire les régions correspondant à la deuxième zone charnière jusqu'au domaine de répétition n°19). L'ADNc de la micro-dystrophine (3,8 Kb) correspondra au mini-ADNc délété en plus des régions suivantes : les domaines de répétition n°3, 20 et 21, la troisième zone charnière, la région C-terminale excepté la séquence codant pour les 3 derniers acides aminés.
Ces constructions sont destinées à être intégrées dans un AAV (Adénovirus Associated Virus), vecteur qui présente les meilleurs caractéristiques pour le transfert de gènes dans le muscle.
Un gène de micro dystrophine vient d'être construit au laboratoire, dont seuls 9 AA aminés diffèrent des séquences protéiques connues. Le test de ce gène en culture de cellules débute actuellement. Si sa fonctionnalité est confirmée, des essais locaux et par voie intraveineuse seront tentés rapidement.


B- Évaluation de la qualité des vecteurs de thérapie génique

Nous testons l'efficacité de vecteurs AAV recombinants dans le muscle (AAV1 vs AAV2, collaboration A. Salvetti INSERM U649) ainsi que de vecteurs non-viraux (polyplexes anioniques, collaboration B. Pitard INSERM U533) en évaluant :
* La diffusion du transfert de gène dans le muscle (à l'aide des gènes rapporteurs beta-galactosidase ou GFP).
* La persistance à long terme du transgène (collaboration I. Anegon (INSERM U 437)).
* L'influence des techniques de purification de l'AAV sur la réaction au virus et au transgène.

C- Dispersion du transgène dans le muscle

La transduction du muscle après injection intra-musculaire par un AAV recombinant est améliorée par l'utilisation préalable de hyaluronidase, tandis que l'usage de collagénase n'est pas efficace.
Cependant la transduction d'un grand nombre de muscles ne peut se concevoir à partir d'injections intramusculaires. L'administration intraveineuse semble incontournable. Nous avons développé des procédures d'injections IV avec surpression chez le chien et le macaque. La protéine marqueur est retrouvée dans un nombre important de fibres musculaires dans de nombreux muscles du membre postérieur (jusqu'à 20% des fibres). L'utilisation de l'érythropoïétine secrétée par le muscle comme protéine marqueur montre que pour une même quantité de vecteur, la transduction est 6 fois plus importante que par voie Intra musculaire.


D- Modèles animaux de Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD)

Deux modèles animaux de DMD sont disponibles au laboratoire. Ils font l'objet d'études lésionnelle et moléculaire :
La souris mdx présente des lésions primaires proches de celles de la DMD (nécrose et régénération) mais ne souffre pas de la sclérose qui se développe chez l'homme. Elle ne présente pas de symptômes locomoteurs et forme donc un modèle imparfait de la DMD. Sa petite taille et sa facilité d'élevage en fait toutefois un modèle utile. Elle nous permet de rechercher les corrélations des variations de la texture du muscle observé en IRM avec les lésions histopathologiques et les modifications histomorphométriques. Ces travaux sont menés à partir de lésions focales expérimentales, à partir de lésions spontanées dues à la dystrophinopathie et de récupérations phénotypiques après transduction du muscle par le gène de la dystrophine ; les paramètres IRM permettant de suivre l'évolution de la structure musculaire ont été définies chez la souris. L'application au chien est en cours de mise au point (collaboration avec J. De Certaines LRMBM-UPRES-EA-2230 Rennes et le SCAS université d'Angers).

Le chien GRMD présente des lésions et des symptômes similaires à ceux de la DMD. C'est un modèle exact de la maladie humaine. Après une description de la forme néo-natale de la maladie chez le chiot, une étude morphométrique et fonctionnelle des dégradations de la vascularisation musculaire au cours du temps a montré que le réseau vasculaire n'est pas profondément modifié mais que des lésions ultra structurales des capillaires peuvent modifier l'efficacité du transfert de gène par vecteur.


E- Évaluation des modifications moléculaires induites par le transfert de gène

La non-expression de la dystrophine chez les animaux myopathes se traduit par une désorganisation du complexe membranaire associé (DGC) considéré par certains auteurs comme une disparition. Une étude réalisée en collaboration avec E. Le Rumeur (LRMBM-UPRES-EA-2230, Rennes) montre que le DGC est modifié dans sa structure et que les protéines du complexe semblent localisées dans des rafts, zones de la membrane résistantes aux détergents.
Une étude menée par microscopie confocale dans notre laboratoire montre que le complexe présent au niveau de la membrane est modifié dans les rapports stéréotaxiques entre les protéines en l'absence de dystrophine. Ces résultats nous fournissent un outils intéressant pour une évaluation fine de l'efficacité du remplacement de la dystrophine par une micro-dystrophine.

AMÉLIORATION DE LA TRANSDUCTION DU MUSCLE : L'AAV (Adenovirus associated virus) est un bon candidat en tant que vecteur pour la thérapie génique.
Localement, l'amélioration de la diffusion in vivo de ce vecteur passe par l'utilisation d'enzymes dissociant le tissu conjonctif. Le stade des lésions musculaires influence aussi l'efficacité de la transduction.
Le tissu musculaire est le tissu le plus représenté dans l'organisme. Pour être valide, une stratégie de thérapie génique doit concerner au moins 30% des fibres d'un muscle et concerner chaque muscle. L'administration du vecteur par voie générale (intraveineuse) est obligatoire pour atteindre une telle quantité de tissu. La transduction du muscle par voie intraveineuse en association à une surpression de 4 atmosphères donne des résultats encourageant chez le chien et le primate (multiplication par 6 du taux d'erythropoiétine sécrétée, utilisée comme marqueur de la transduction musculaire).

MODÈLES ANIMAUX DE DYSTROPHIE MUSCULAIRE DE DUCHENNE : Les modèles animaux de la dystrophie musculaire de Duchenne sont la souris mdx et le chien GRMD. Pour valider ces modèles et déterminer leur validité dans les diverses expérimentations, une étude des lésions est réalisée chez le chien et la souris : le modèle souris mdx peut être utilisé dans les études pathogéniques des phénomènes de nécrose-régénération. Le chien GRMD est un modèle quasi-parfait de la maladie humaine et peut être utilisé pour les expérimentations concernant la pathogénie et pour les essais de thérapie.

THÉRAPIE GÉNIQUE DE LA DYSTROPHIE DE DUCHENNE PAR UTILISATION D'UNE MICRO DYSTROPHINE : La dystrophine est le plus grand gène existant. Pour construire un vecteur AAV traitant la dystrophie de Duchenne, il faut créer un micro gène (correspondant à la mutation qui provoque la dystrophie de Becker, forme moins grave de dystrophie). Cette construction n'existe pas pour l'espèce canine, ce qui interdit actuellement les essais homologues dans cette espèce.
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